Gruppo di ricerca di Tecnologia Farmaceutica, Università degli Studi di Firenze, Phytolab

Prof. A. R. Bilia, Dott.ssa M. C. Bergonzi, Dott.ssa Clizia Guccione

Il gruppo di ricerca della professoressa Anna Rita Bilia si interessa di studiare molecole bioattive provenienti da matrici vegetali. Il gruppo ha un importante background nell'analisi e nella formulazione di droghe vegetali, preparati a base di droghe vegetali e fitoterapici. Le principali linee di ricerca includono il miglioramento della biodisponibilità e delle caratteristiche tecnologiche applicando strumenti di tecnologia farmaceutica innovativa (liposomi, nanoparticelle, complessi supramolecolari, micelle) al mondo dei composti naturali.

I principali temi di ricerca sono:

1- Studio di aspetti farmacologici e tecnologici di estratti vegetali, preparati a base di droghe vegetali e fitoterapici tra cui:
1a-miglioramento della biodisponibilità e delle caratteristiche tecnologiche di estratti vegetali e dei singoli componenti isolati. Progettazione e sviluppo di formulazioni innovative utilizzando micro e nanovettori come nanoparticelle, liposomi e micelle, vescicole, complessi sopramolecolari con ciclodestrine, nanocapsule e nanoparticelle solide lipidiche. Caratterizzazione dei micro e nanovettori con metodi convenzionali (HPLC, DSC, UV, dispersione della luce, test di dissoluzione, TEM) e innovativi come NMR (ROESY e DOSY),
1b-autenticazione, controllo di qualità e test di stabilità con metodi non solo convenzionali, ma anche non convenzionali come la 1D e 2D NMR, NIR e biosensori ,

2-Isolamento e determinazione strutturale dei costituenti secondari delle piante.
Il gruppo ha lavorato per lungo tempo allo sviluppo di formulazioni caricate con artemisinina per aumentare la loro biodisponibilità. L’ artemisinina è un endoperossido sesquiterpene lattone isolato da Artemisia annua L. La sua attività contro la malaria grave e cerebrale è ampiamente descritta in letteratura. Ha, però, scarse proprietà biofarmaceutiche, che hanno limitato il suo utilizzo. Sono stati formulati liposomi per veicolare l’ artemisinina. Liposomi convenzionali e pegilati caricati con artemisinina sono stati preparati secondo il metodo dell’idratazione del film lipidico. La biodisponibilità dell’ artemisinina e delle diverse formulazioni liposomiali è stata valutata nel topo sano. Le formulazioni sono state caratterizzate in termini dimensionali mediante Dynamic Light Scattering, morfologicamente attraverso il TEM, mentre l’Efficienza di incapsulazione è stata valutata con analisi HPLC/DAD/ ESI MS.
La diidroartemisinina è uno dei composti antitumorali più potenti con struttura simile all’artemisinina, è in grado di indurre la morte delle cellule tumorali per apoptosi. La sua efficacia è molto elevata ma è una molecola poco solubile in acqua, con bassa biodisponibilità e un’ emivita molto bassa (34-90 min), quindi, è stato necessario sviluppare nuove formulazioni di diidroartemisinina per aumentare la sua biodisponibilità. Per la prima volta sono stati formulati liposomi convenzionali e stealth caricati con diidroartemisinina come antitumorale. La stabilità chimico- fisica è stata valutata in condizioni di stoccaggio e in presenza di albumina. L’uptake cellulare dei liposomi è stato determinato mediante citometria di flusso.
E’ stata valutata, dal gruppo di ricerca, anche l’efficacia terapeutica di nuovi sistemi liposomiali a base di artemisinina (terapie combinate a base di artemisinina)in combinazione con la curcumina. I liposomi ottenuti hanno le caratteristiche adeguate per una somministrazione parenterale in termini di dimensioni, omogeneità, efficienza di incapsulazione e carica superficiale. E’ stata valutata, inoltre, la loro stabilità chimico-fisica. L'attività antimalarica delle formulazioni liposomiali a base di artemisinina e’ stata testata in in vivo sui topi P. Berghei NK-65 infetti. L’ artemisinina, da sola o in combinazione con la curcumina, è stata incapsulata in liposomi convenzionali e pegilati ed è stata valutata la sua performance in vivo rispetto al farmaco libero.
Per il trattamento della psoriasi sono state realizzate microsfere di curcumina in grado di veicolare azatioprina. Il carrier è stato formulato, caratterizzato ed ottimizzato, quindi ne è stata testata l’ attività in vitro.
Sono stati realizzati e ottimizzati liposomi convenzionali e pegilati caricati con acido salvianolico B (SalB), uno dei costituenti della Salvia miltiorrhiza Bge, con una forte attività scavenger dei radicali liberi. La molecola presenta instabilità chimica e scarsa biodisponibilità, quindi sono stati formulati liposomi per la somministrazione parenterale.
Negli ultimi tre anni, il gruppo ha studiato, inoltre, nanoparticelle solide lipidiche (SLNs) e vettori nanostrutturati lipidici (NLCs) per la somministrazione orale di curcumina. Nonostante i molteplici effetti benefici per la salute, l’ azione della curcumina è fortemente limitata dalla sua scarsa solubilità in acqua e dalla bassa biodisponibilità orale. I vettori ottenuti sono stati caratterizzati in termini di dimensioni, potenziale zeta, capacità di caricamento del farmaco, efficienza di incapsulazione, analisi morfologica mediante TEM ed è stato valutato il rilascio del farmaco in vitro. La stabilità è stato osservata in condizioni di conservazione (4 ° C) per oltre un mese. L’utilizzo delle PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability in vitro Assay) ha mostrato un notevole aumento della quantità di curcumina permeata nel caso delle sospensioni di SLN e NLC rispetto alla soluzione satura di curcumina utilizzata come controllo.
Molto recentemente sono state progettate nuove nanoparticelle polimeriche innovative per il trasporto e il direzionamento di farmaci al SNC. Sono stati formulati due tipi di nanosfere fluorescenti (NSs): NSs a base di alchil ciano acrilato rivestite con polisorbato 80 e NSs di albumina sierica umana. I due sistemi sono stati preparati in maniera diversa ,rispettivamente, mediante il metodo di emulsione per polimerizzazione e per coacervazione con cross-linking sia termico che chimico usando come reticolazione la glutaraldeide. Le NSs sono state caratterizzati in termini di analisi dimensionale, indice di polidispersione ,potenziale Zeta, analisi morfologica, efficienza di incapsulazione e capacità di caricamento. Tutti e tre i sistemi ottenuti sono stati testati in vivo per valutare il passaggio attraverso la BEE, la biodistribuzione e la tossicità. Sono stati iniettati per via intraperitoneale, endovenosa e nel nucleo basale magnocellulare di ratti anestetizzati. La biodistribuzione è stata valutata al microscopio a fluorescenza.
Negli ultimi anni il gruppo ha valutato l'effetto dell’ incapsulamento in sistemi micellari e in ciclodestrine sulla solubilità, biodisponibilità e stabilità delle molecole di origine naturale.
Sono stati studiati gli effetti delle micelle di SDS e acido ottanoile-6-O-ascorbico (ASC8) e delle ciclodestrine sulle proprietà biofarmaceutiche dell’ estratto di Hypericum perforatum L.. Lo scopo del lavoro era di sviluppare nuove formulazioni orali con una farmacocinetica migliore, un più rapido inizio dell’effetto terapeutico e con un’ azione prolungata rispetto all'estratto tal quale, verificando la possibilità di ridurre la dose di estratto totale ottenendo lo stesso effetto antidepressivo con minori potenziali effetti collaterali. Infine, è stata valutata la solubilità dei costituenti dell'estratto all'interno delle formulazioni per chiarire meglio i risultati ottenuti dalle prove farmacologiche.
L'acido ottanoile-6-O-ascorbico è stato utilizzato anche per proteggere tutti i componenti caratteristici di Hypericum perforatum L., da processi di ossidazione. Data la capacità intrinseca di acido ottanoile-6-O-ascorbico di formare micelle, è stata anche aumentata anche la solubilità in acqua dei componenti. E’ stata valutata la stabilità alla luce e al calore di un estratto secco commerciale in presenza di acido ottanoile-6-O-ascorbico secondo le condizioni di prova ICH.
Il gruppo ha studiato, inoltre, le interazioni di alcuni flavonoidi naturali con ciclodestrine naturali. Le molecole studiate sono state la galangina, il kaempferolo e la quercetina. Sono stati preparati i complessi di inclusione, quindi liofilizzazati. Sono stati caratterizzati utilizzando diversi metodi fisico-chimici basati su calorimetria differenziale a scansione (DSC), spettroscopia infrarossa (IR) e spettroscopia NMR. Inoltre, è stata anche valutata la solubilità in acqua dei flavonoli in presenza di ciclodestrine.
E' stata anche aumentata la solubilità dei kavalattoni; costituenti polari ma scarsamente solubile in acqua con una bassa biodisponibilità. La formazione di complessi di inclusione con beta-ciclodestrina di uno dei più rappresentativi kavalattone, (S) -7,8-dihydrokavain (DHK) isolato dall’estratto di kava-kava, è stata studiata principalmente con metodi spettroscopici. Esperimenti NMR sono stati ampiamente utilizzati per la caratterizzazione completa del complesso, inclusi 1H NMR, DOSY e ROESY.